血涂片制備和細胞染色的基本方法-2018檢驗技師考試精華考點

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　　血涂片的顯微檢查是血液細胞學檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價值，近年來血細胞分析儀的廣泛應(yīng)用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結(jié)果的簡易方法。比臺觀察10個高倍視野血涂片中白細胞和血小板數(shù)大致估計血內(nèi)這些細胞的數(shù)量，借以作為儀器結(jié)果分析后質(zhì)控的參考。

　　但積壓涂片制備和染色不良，常使細胞鑒別發(fā)生困難，甚至導致錯誤結(jié)論。例如，血膜過厚細胞重疊縮小，血膜太薄白細胞多集中于邊緣，細胞分布不勻;染色偏酸或偏堿均可使細胞染色反應(yīng)異常。因皮制備厚薄適宜，分布均勻，染色良好的血涂片是血液學檢查的重要革本技術(shù)之一。

　　血涂片制備方法及注意事項將在實習指導中詳細介紹。

　　1.瑞特(Wright)染色法：為發(fā)觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，識別各種細胞及其異常變化，血涂片必須嘲行染色。血涂片的各種染色方法大多是羅氏染色法衍變來的。目前常用瑞特染色法。

　　(1)瑞特染料是由酸性染料伊紅和堿性染料亞甲藍組成有復合染料。亞甲藍為四甲基硫堇染料，有對醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu)。通常為氯鹽，即氯化美藍。美藍容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料。市售美藍中部分已被氧化為天青。伊紅通常為鈉鹽。即伊紅和伊混合后，產(chǎn)生一種憎液性膠體伊紅美藍中性沉淀，即瑞特染料。

　　(2)細胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學的親和作用，各種細胞成分化學性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì);細胞核蛋白和淋巴細胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍或天青結(jié)合，染紫藍色，稱為嗜堿性物質(zhì);中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。

　　(3)PH對細胞染色有影響。細胞各種成分均不蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中下在電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅;在偏三性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍或天青結(jié)合，染色偏藍。因此細胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用正經(jīng)片必須清潔，無酸堿污染。配制頊特液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導致各種細胞染色反應(yīng)異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。

　　新鮮配制的染料偏堿，須在室溫或是37℃下貯存一定時間，待染料成熟，主要是美藍逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樘烨郆后才能使用，貯存時愈久，染色效果愈好。EAm GILLILAND等采用吸光度比值作為頊特染液的質(zhì)量規(guī)格。rA測定方法如下：取瑞特染液15-25μl(視染液濃度而定)，加甲醇10ml稀釋，混勻后以甲醇為空折管，分別以波長650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因為美藍吸收峰小組長為650nm，伊紅吸收峰波長為525nm ;天青B吸收峰也為650nm但吸光度A約為美藍的一半。所以新配染料rA接近2，隨著美藍逐漸氧化為天青B，RA也相應(yīng)下降。RA下降到1.3±0.1時即可使用。瑞特染液貯存過程中，必須塞嚴，以防止甲醇揮發(fā)和被氧化成甲酸。有人主張在配方中加入甘油30ml，防止甲醇揮發(fā)，關(guān)可合細胞染色清晰。甲醇必須純凈，如甲醇中丙酮含量過多，染色偏酸，使白細胞著色不良。

　　2.吉姆薩(Giemsa)染色法：吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié)果與瑞特染色法基本相同。但本法對細胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更不清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長，可用復合染色法。即以稀釋吉姆薩液代替緩沖液，按瑞特染色法染10min.或先用瑞特染色法染色后，再用稀釋吉姆薩復染。

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