2015初級(jí)檢驗(yàn)技師考試：特異性IgG抗體制備

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　　在標(biāo)記的免疫測(cè)定或其他技術(shù)中將特異性抗體純化出來(lái)，是極為重要的。例如在ELISA，用于包被的抗體一定要用特異性IgG，才能得到良好的效果。這是因?yàn)槿�血清中有大量非抗體蛋白，如白蛋白、α1和α2球蛋白等，如不除去，會(huì)干擾包被。再如反相間接血凝，致敏紅細(xì)胞的抗體也需用特異性IgG的 I(ab')2才能使實(shí)驗(yàn)滿意。特異性IgG和F(ab')2的制備方法有如下幾種。

　　(一)粗提法提取球蛋白

　　大多用硫酸銨鹽析法或硫酸鈉鹽析法。硫酸銨鹽析須經(jīng)過(guò)多次沉淀，第一次用40%飽和度，第二次用35%飽和度，第三次用33%飽和度，經(jīng)三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸鈉法更簡(jiǎn)便，用20%即可將γ球蛋白沉淀出來(lái)。

　　經(jīng)鹽析后的γ球蛋白雖大多屬于IgG，但還有5%其他區(qū)帶蛋白，如γ區(qū)的雜蛋白。又因IgG組分中還含其他所謂正常的IgG，產(chǎn)生干擾。因此鹽析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的實(shí)驗(yàn)，或者是抗體效價(jià)較高的抗血清。

　　(二)離子交換層析法提取IgG

　　常用的離子交換劑有DEAE纖維素或QAE纖維素，以QAE-Sephadex最為理想，DE22、32、52也可應(yīng)用。取QAE- SephadexA25或A50經(jīng)酸處理并在0.05mol/LpH7.5～8.6的磷酸鹽緩沖液中平衡，將水分抽干，稱濕重Ig加于10ml血清中，在室溫30min后，離心或過(guò)濾除去離子交換劑。上清液再如此處理一次，即獲得較純的IgG，甚至不含其他雜蛋白。用該技術(shù)純化IgG簡(jiǎn)便，不損壞抗體，既可小量提取，也可大量制備。

　　(三)親和層析法提取特異性IgG

　　將純化抗原或粗制抗原(如是單價(jià)特異性則對(duì)抗原要求不高)交聯(lián)Sepharose4B制成親和層析柱，將抗血清過(guò)柱后洗去未結(jié)合的雜蛋白，再用硫氰酸鉀洗脫，流出的是純的特異性IgG抗體。因硫氰酸鉀對(duì)抗體有破壞作用，應(yīng)及時(shí)透析除去。純化的IgG因含量低，失去保護(hù)作用，應(yīng)及時(shí)應(yīng)用或凍干保存，亦可20℃保存，但皆不理想;加入三乙醇胺或甘油可起保護(hù)作用。

　　(四)酶解法制備F(ab')2片段

　　胃蛋白酶對(duì)IgG的作用點(diǎn)是在連接兩重鏈的二硫鍵靠C端處(232氨基酸處)，結(jié)果兩個(gè)Fab由二硫鍵連接，保留了抗體的結(jié)合點(diǎn)。與IgG相比，F(xiàn)(ab')2的特點(diǎn)是去掉了Fc段，這樣在細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)中免除了受體作用;同時(shí)也使IgG失去主要的抗原特性，不被抗IgG抗體結(jié)合;在反向間接血凝中，用F(ab')2致敏羊紅細(xì)胞比用IgG效果好。