藥學類輔導：病毒核酸及抗原的直接檢出

    (一)直接檢出病毒核酸

　　1.標本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結(jié)合到膜上，在原位進行鹼變性處理后，有放射標記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按鹼基到補原則結(jié)合成雙股，經(jīng)放射自顯影，陽性結(jié)果出現(xiàn)斑點狀雜交信號。含輪狀病毒的糞便標本經(jīng)熱變性處理，點到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標記探針做斑點雜交，敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補的DNA探針做斑點雜交。

　　目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病人標本中的病毒DNA，也用于檢測不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標本中的病毒DNA。

　　2.多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴增法。先將待檢標本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個鹼基互補的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3?端引物向5?端延伸DNA鏈，經(jīng)20～40個循環(huán)，可使1個拷貝的核酸擴增至106以上，經(jīng)瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標本，有較大應(yīng)用前景。

　　(二)直接檢測病毒抗原

　　1.免疫熒光(IF)技術(shù)如前所述IF可用于細胞培養(yǎng)病毒的鑒定，也適用檢測臨床標本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標記特異性抗體，檢測病毒抗原;間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標本中抗原結(jié)合，再用熒光素標記的抗體與特異性抗體結(jié)合，從而間接識別抗原。可取咽喉脫落細胞，檢測呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原;取病灶刮片或腦活檢標本，檢測單純皰疹病毒抗原;取尿沉渣檢測巨細胞病毒抗原等。近年來使用單克隆抗體大大提高了檢測的靈敏度和準確性。

　　2.免疫酶法(IEA)原理與應(yīng)用范圍同免疫熒光技術(shù)，IEA是用酶(通常是過氧化物酶)取代熒光素標記抗體，酶催化底物形成有色產(chǎn)物，在普通光學顯微鏡下清晰可見，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。

　　3.放射免疫測定法(RIA)有競爭RIA和因相RNA二種方法。競急RIA是同位素標記的已知抗原與標本中未標記的待檢抗原競爭性結(jié)合特異性抗體的試驗，將形成的復合物分離出來，用放射免疫檢測儀測定放射活性，同時與系列稀釋的標準抗原測定結(jié)果進行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標本中的抗原，然后加入放射性標記的特異性抗體與抗原結(jié)合，測定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

　　4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)先將特異性抗體包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉標本中相應(yīng)抗原，然后加入酶標特異性抗體，相應(yīng)抗原被夾在抗體之間，當加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質(zhì)，已被多數(shù)實驗室采用。

　　此外，對難以分離培養(yǎng)，形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。